微流控設(shè)備：應(yīng)用于剪切應(yīng)力在黑色素瘤轉(zhuǎn)移中的潛在功能研究

一、前言

癌癥的不良預(yù)后與腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的能力有關(guān)。在轉(zhuǎn)移過程中，血液或淋巴管中循環(huán)的腫瘤細(xì)胞可以粘附并穿過內(nèi)皮侵入結(jié)締組織。大多數(shù)與癌癥相關(guān)的死亡是由轉(zhuǎn)移形成引起的。從腫瘤細(xì)胞與原發(fā)性腫瘤分離開始，到侵入組織，進(jìn)入血管或淋巴管（內(nèi)滲），并運(yùn)輸?shù)竭h(yuǎn)程部位。

人們普遍認(rèn)為，腫瘤細(xì)胞隨后可以從微血管系統(tǒng)中逃逸（外滲），侵入靶組織并在遠(yuǎn)處器官中形成繼發(fā)性腫瘤。

因此，在轉(zhuǎn)移中一個(gè)潛在的限速步驟是外滲，該過程涉及腫瘤細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的粘附，以及通過內(nèi)皮細(xì)胞單層和基底膜的遷移。黑色素瘤是具侵襲性的皮膚癌之一，它會(huì)侵入皮膚的深層，并有早期轉(zhuǎn)移的傾向。

為了深入了解黑色素瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的機(jī)制，本文介紹了一種利用Cellix VenaFlux平臺(tái)研究生理剪切流條件下黑色素瘤同基因模型中不同細(xì)胞粘附情況的應(yīng)用實(shí)例。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1. 細(xì)胞收獲

黑色素瘤細(xì)胞系（1205-Lu、WM793、WM793-P1和WM793-P2）和綠色熒光蛋白標(biāo)記的黑色素瘤細(xì)胞系GFP-1205Lu維持在含有GlutaMAX（Invitrogen）的DMEM中，輔以10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 µg/ml 鏈霉素和 4 µg/ml 胰島素。人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞系 (HUVEC) 維持在含有1g/L葡萄糖 (Invitrogen)、補(bǔ)充有10%胎牛血清、5 ml/L慶大霉素和10 ml/L兩性霉素B溶液的DMEM中。

2. Vena8 Fluoro+ 生物芯片涂層

Vena8 Fluoro+生物芯片（400µm寬，100µm深）在涂上BSA (10 µg/ml)阻斷非特異性結(jié)合之前，在4°C的潮濕條件下用rhICAM-1(10 µg/ml)、rhVCAM-1(10 µg/ml) 或纖連蛋白(20 µg/ml)包被過夜。兩個(gè)額外的通道在室溫下用BSA涂敷兩小時(shí)。在剪切實(shí)驗(yàn)之前，所有通道都用培養(yǎng)基洗滌三次

3.VenaEC 生物芯片培養(yǎng)程序

將VenaEC生物芯片置于35 mm培養(yǎng)皿中（面積 9.61 cm^2）并在細(xì)胞接種前進(jìn)行紫外線消毒20分鐘。將HUVEC細(xì)胞以75,000個(gè)細(xì)胞/cm^2 的密度接種在生物芯片上，并使其融合48小時(shí)。組裝的生物芯片（微通道600µm 寬，120µm深）在10 dyne/cm^2的剪切應(yīng)力下預(yù)處理10分鐘，然后在0.5 dyne/cm^2 的剪切應(yīng)力下預(yù)處理10分鐘。

4.附著力曲線和圖像捕獲

將黑色素瘤細(xì)胞系1205Lu、WM793、WM793-P1和WM793-P2（濃度5 x 10^6個(gè)細(xì)胞/ml）在 (A) 0.5 dyne/cm^2 的限定剪切應(yīng)力下注入涂層通道，持續(xù)時(shí)間為 5 min（累積測定）或 (B) 5、2 和 0.5 dyne/cm^2 的遞減梯度剪切應(yīng)力，持續(xù)時(shí)間為 2 min/剪切應(yīng)力。使用Cellix的VenaFlux分析軟件捕獲圖像并使用Image Pro Premier軟件進(jìn)行分析。從四個(gè)實(shí)驗(yàn)中獲得數(shù)據(jù)并導(dǎo)出到Excel中以進(jìn)行進(jìn)一步分析。

使用VenaEC生物芯片檢查GFP-1205Lu細(xì)胞的粘附特性。GFP標(biāo)記的細(xì)胞在匯合的HUVEC單層上受到0.5dyne/cm^2的剪切應(yīng)力。在配備LD A-Plan 20x/0.30物鏡、0.5x相機(jī)適配器和DeltaPix DP200相機(jī)的Zeiss Axiovert 25 CFL顯微鏡上使用相差對(duì)單層進(jìn)行成像。然后使用Zeiss濾光片組#9（激發(fā)BP450-490 nm，發(fā)射LP515）對(duì)熒光標(biāo)記的黑色素瘤細(xì)胞進(jìn)行成像。

三、結(jié)果與討論

在這項(xiàng)研究中，WM793、WM793-P1和WM793-P2細(xì)胞在0.5 dyne/cm^2的恒定剪切應(yīng)力下沒有粘附到指定的粘附子上，而1205-Lu細(xì)胞在類似的剪切下粘附到V-CAM上（圖 1）。為了確定1205Lu細(xì)胞粘附到V-CAM的閾值剪切應(yīng)力，施加了5、2和0.5 dyne/cm^2的遞減剪切應(yīng)力，這導(dǎo)致1205-Lu細(xì)胞在剪切應(yīng)力低于2dyne/cm^2時(shí)粘附增加（圖 2）。GFP-1205Lu細(xì)胞受到0.5 dyne/cm^2的剪切應(yīng)力，并記錄到與內(nèi)皮細(xì)胞的粘附（圖 3）。

圖1：黑色素瘤細(xì)胞在0.5dyne/cm^2 的恒定剪切應(yīng)力下粘附到rhVCAM-1

圖2：1205Lu細(xì)胞粘附到rhVCAM-1上的閾值

圖3：GFP-1205Lu粘附在內(nèi)皮細(xì)胞上的代表性顯微鏡圖像

同基因模型系列由致瘤性差的黑色素瘤親代細(xì)胞系WM793及其衍生物WM793-P1、WM793-P2（來自小鼠在WM793注射部位發(fā)育的腫瘤）和1205-Lu（小鼠皮下注射WM793后發(fā)生自發(fā)性肺轉(zhuǎn)移，與親本系相比，在體外顯示出生長、侵襲和致瘤性增加）。

我們的研究結(jié)果表明，剪切應(yīng)力在外滲過程中起重要作用。1205-Lu細(xì)胞在較高剪切應(yīng)力下附著于V-CAM的能力可能有助于其外滲能力，從而有助于其轉(zhuǎn)移。有趣的是，除了1205-Lu細(xì)胞外，所有細(xì)胞系在靜態(tài)條件下都具有高度粘附性，但在流動(dòng)條件下卻無法粘附。

VenaFlux平臺(tái)是一款半自動(dòng)化的微流控平臺(tái)，能在模擬體內(nèi)流速的剪切流下執(zhí)行細(xì)胞滾動(dòng)、結(jié)合/粘附和遷移研究，可滿足剪切流下進(jìn)行細(xì)胞檢測的高通量需求。

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