利用腸道芯片和4D成像了解病原體入侵

1 摘要

1.1 實(shí)時(shí)機(jī)械生物學(xué)研究挑戰(zhàn)

在病原體與人體之間復(fù)雜的相互作用過(guò)程中，機(jī)械信號(hào)發(fā)揮著重要作用，它決定著基因表達(dá)、黏附動(dòng)力學(xué)，甚至形態(tài)發(fā)生。從細(xì)胞外基質(zhì)的密度、泌尿道中流體流動(dòng)的剪切力，到血管的迂曲程度，機(jī)械生物學(xué)領(lǐng)域與基礎(chǔ)生物學(xué)過(guò)程緊密交織。然而，要實(shí)時(shí)捕捉這些動(dòng)態(tài)變化，尤其是在像腸道這樣復(fù)雜的微環(huán)境中，一直是一個(gè)難題，因?yàn)楣簿劢癸@微鏡的成像速度太慢，無(wú)法對(duì)腸道蠕動(dòng)進(jìn)行成像 [1] 。

1.2 腸道芯片模型

器官芯片（OoC）技術(shù)的發(fā)展為研究機(jī)械生物學(xué)事件開(kāi)辟了新的契機(jī)。該技術(shù)所構(gòu)建的微型生態(tài)系統(tǒng)能夠以較高的保真度模擬生理?xiàng)l件，尤其適用于研究那些僅在人類(lèi)中出現(xiàn)且無(wú)法在動(dòng)物模型中復(fù)制的病癥。通過(guò)整合多種細(xì)胞類(lèi)型以及有助于維持體內(nèi)平衡條件的多孔膜，器官芯片平臺(tái)在引入諸如流體流動(dòng)和蠕動(dòng)等關(guān)鍵要素的同時(shí)，還能模擬器官的微觀結(jié)構(gòu)。但要獲得全面的研究見(jiàn)解仍面臨諸多障礙，尤其是在實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)三維成像以及研究瞬時(shí)事件方面。

該研究涉及兩種病原體的入侵機(jī)制：

1.2.1 溶組織阿米巴變形蟲(chóng)（導(dǎo)致阿米巴病）

阿米巴病是由溶組織阿米巴變形蟲(chóng)引起的，溶組織阿米巴變形蟲(chóng)是一種專(zhuān)門(mén)攻擊人類(lèi)的寄生蟲(chóng)。雖然許多感染沒(méi)有癥狀，但一旦寄生蟲(chóng)突破腸道內(nèi)壁，就會(huì)引發(fā)疼痛性腹瀉，并伴有出血和潰瘍形成。更嚴(yán)重的話，阿米巴病可能會(huì)升級(jí)為肝臟、肺和腦等重要器官膿腫的形成。

圖1 溶組織內(nèi)阿米巴（紅色輪廓）正在破壞人類(lèi)結(jié)腸的粘液層

1.2.2 志賀氏菌（導(dǎo)致志賀氏菌病的細(xì)菌）

志賀菌病由志賀菌感染引起，志賀菌是大腸桿菌的不同變種。這些細(xì)菌攜帶著一種毒力質(zhì)粒，使其能夠僅侵入人類(lèi)腸道上皮細(xì)胞，隨后侵入黏膜層。這種入侵會(huì)引發(fā)嚴(yán)重的炎癥，并伴隨著廣泛的組織損傷。

圖2 志賀菌侵入人類(lèi)腸道上皮細(xì)胞

2 研究目的

這項(xiàng)工作目的是在周期性變形條件下對(duì)芯片器官進(jìn)行四維實(shí)時(shí)成像，模擬腸道的蠕動(dòng)運(yùn)動(dòng)。除了實(shí)現(xiàn)可視化之外，這種方法還能揭示組織的流變學(xué)特性，為深入了解機(jī)械應(yīng)力的時(shí)空分布提供了新的視角。該研究以腸道屏障為重點(diǎn)，展現(xiàn)了機(jī)械信號(hào)與病原體侵襲之間的相互作用，突出了溶組織內(nèi)阿米巴和志賀氏菌的致病機(jī)制。

研究觀察了多種參數(shù)：宿主細(xì)胞的死亡情況、組織的連接性、病原體的追蹤、入侵及定殖情況，以及應(yīng)力相關(guān)性。

3 實(shí)驗(yàn)設(shè)置

3.1 材料

l 腸道芯片

l T2i 旋轉(zhuǎn)盤(pán)共聚焦顯微鏡

l ORCA-Flash 4.0 數(shù)字 CMOS 相機(jī)

l OB1 MK3+ 流量控制器

l MSF 流量傳感器

l Elveflow 軟件界面

圖3 從細(xì)胞培養(yǎng)到數(shù)據(jù)分析的端到端工作流程示意圖

3.2 4D實(shí)時(shí)成像優(yōu)化

首先，在蠕動(dòng)條件下獲取視頻面臨多項(xiàng)挑戰(zhàn)，本研究已解決：

l 對(duì)齊問(wèn)題：視頻序列通常與周期性蠕動(dòng)運(yùn)動(dòng)不同步。為了解決這個(gè)問(wèn)題，有必要將其對(duì)齊到一個(gè)四維數(shù)據(jù)堆棧中，同時(shí)要考慮到周期之間的時(shí)間延遲。

l 組織曲率：組織的曲率可能導(dǎo)致圖像失焦，這就需要進(jìn)行二維投影處理。

l 運(yùn)動(dòng)校正：可能發(fā)生平面外運(yùn)動(dòng)，需要運(yùn)動(dòng)校正技術(shù)來(lái)確保成像準(zhǔn)確。

3.3 腸道芯片感染實(shí)驗(yàn)
腸道芯片包含兩個(gè)腔室。上腔室灌注有培養(yǎng)基，并培養(yǎng)著Caco2細(xì)胞，而下腔室則專(zhuān)門(mén)用于灌注培養(yǎng)基。一塊橫向的膜能夠進(jìn)行機(jī)械拉伸，以模擬腸道的蠕動(dòng)運(yùn)動(dòng)。隨后通過(guò)向該系統(tǒng)中注入受感染的培養(yǎng)物，從而實(shí)現(xiàn)了細(xì)菌和類(lèi)變形蟲(chóng)的感染。

3.4 微流體蠕動(dòng)應(yīng)力設(shè)置
該微流控裝置通過(guò)點(diǎn)成Elveflow的 ESI 軟件進(jìn)行監(jiān)控，并使用 OB1壓力控制器在三通道設(shè)置下進(jìn)行監(jiān)測(cè)（見(jiàn)圖 4）：

l 通道 1：向腸道芯片的頂部通道灌注培養(yǎng)基，該通道內(nèi)含有Caco2細(xì)胞（源自人類(lèi)結(jié)腸的上皮細(xì)胞）。連接MFS流量傳感器（流速為每小時(shí)30微升）。

l 通道 2：向腸道芯片的底部通道灌注培養(yǎng)基。連接MFS流量傳感器（流速為每小時(shí)30微升）。

l 通道 3：進(jìn)行側(cè)向真空拉伸操作，以模擬結(jié)腸的蠕動(dòng)（幅度為10%，頻率為0.15Hz）。

圖4 點(diǎn)成Elveflow 微流體裝置采用芯片模擬腸道，以重現(xiàn)蠕動(dòng)運(yùn)動(dòng)

4 主要發(fā)現(xiàn)

實(shí)驗(yàn)控制參數(shù)說(shuō)明：WP：存在類(lèi)似蠕動(dòng)的拉伸；WOP：不存在類(lèi)似蠕動(dòng)的拉伸；福氏志賀菌 - mxiD：無(wú)毒菌株；TSAR 福氏志賀菌菌株在三型分泌系統(tǒng)（T3SS）激活時(shí)會(huì)表達(dá)綠色熒光蛋白（GFP）（這是毒力基因誘導(dǎo)的標(biāo)志物，可使細(xì)菌侵入宿主細(xì)胞）；半胱氨酸蛋白酶抑制劑（E64）可抑制變形蟲(chóng)對(duì)細(xì)胞膜的降解作用。

4.1 組織流變學(xué)模型的建立

為了比較局部應(yīng)力和局部毒力，建立了一個(gè)組織流變學(xué)研究模型。然而，芯片的封裝結(jié)構(gòu)使得無(wú)法使用流變學(xué)探針，并且與壓力泵指令相比，聚二甲基硅氧烷（PDMS）支架會(huì)改變機(jī)械性能。因此，基于視頻分析開(kāi)發(fā)了一個(gè)可靠的數(shù)學(xué)模型來(lái)應(yīng)對(duì)這些挑戰(zhàn)。

4.2 福氏志賀氏菌的動(dòng)態(tài)入侵過(guò)程

為了研究福氏志賀菌的感染動(dòng)態(tài)，研究人員在感染后的 1 至 2 小時(shí)內(nèi)持續(xù)進(jìn)行監(jiān)測(cè)，并將結(jié)果與無(wú)毒菌株（福氏志賀菌 - mxiD）進(jìn)行對(duì)比。他們觀察了兩個(gè)關(guān)鍵參數(shù)：細(xì)菌菌落的擴(kuò)展程度以及單個(gè)細(xì)菌侵入所需的時(shí)間。

4.2.1蠕動(dòng)促進(jìn)細(xì)菌定殖，使其更早開(kāi)始且擴(kuò)展更迅速

事實(shí)上，隨著蠕動(dòng)運(yùn)動(dòng)的發(fā)生，細(xì)菌數(shù)量顯著增加（圖 5A）。此外，在感染后的最初 2 小時(shí)內(nèi)，TSAR（三型分泌系統(tǒng)激活相關(guān)指標(biāo)）的激活經(jīng)歷了兩個(gè)不同階段，這表明在有蠕動(dòng)的情況下，毒力基因會(huì)更早且更廣泛地被誘導(dǎo)激活（圖 5B）。

圖5 福氏志賀氏菌的組織入侵 

A) 生長(zhǎng)菌落中的細(xì)菌數(shù)量 (N=8)，B) 作為其分泌系統(tǒng)標(biāo)記的 TSAR 激活細(xì)菌數(shù)量示例曲線 (N=4)

4.2.2 局部機(jī)械應(yīng)力加速細(xì)菌在細(xì)胞間的傳播

研究人員通過(guò)比較單個(gè)細(xì)菌中 TSAR 的激活速度，來(lái)探究局部機(jī)械應(yīng)力對(duì)福氏志賀菌的影響。為了實(shí)現(xiàn)這一目的，利用藍(lán)色膜探針 Pro12A 計(jì)算出組織的應(yīng)力圖譜，并將其與單個(gè)細(xì)菌的 TSAR 激活情況進(jìn)行對(duì)比。如圖 6 所示，研究人員觀察到，在上皮應(yīng)力較高的區(qū)域，細(xì)菌的激活時(shí)間明顯更早。

圖6 疊加了 TSAR 激活時(shí)間的應(yīng)力圖（一個(gè)周期的平均值）；

每個(gè)點(diǎn)對(duì)應(yīng)于跟蹤激活的 (x, y) 坐標(biāo)（越暗，激活時(shí)間越快）

4.3 溶組織內(nèi)阿米巴原蟲(chóng)的動(dòng)態(tài)侵襲過(guò)程

在對(duì)溶組織內(nèi)阿米巴的感染研究中，研究人員采用了嚴(yán)格的 7 小時(shí)監(jiān)測(cè)期，以 30 分鐘或 1 小時(shí)為間隔進(jìn)行觀察，并與使用半胱氨酸蛋白酶抑制劑（E64）來(lái)防止細(xì)胞降解的對(duì)照組進(jìn)行對(duì)比。研究人員觀察了三個(gè)關(guān)鍵參數(shù)：細(xì)胞死亡情況、組織連接性以及病原體的侵入情況。

4.3.1 蠕動(dòng)促進(jìn)類(lèi)變形蟲(chóng)對(duì)組織的降解和侵襲

通過(guò)熒光顯微鏡分析發(fā)現(xiàn)，與靜態(tài)組織（無(wú)蠕動(dòng)，即 WOP）相比，在類(lèi)變形蟲(chóng)感染 3 小時(shí)后，有蠕動(dòng)（WP）的情況下細(xì)胞死亡率增加了 10%（圖 7A）。為了研究組織損傷情況，研究人員還觀察了細(xì)胞的連接性，結(jié)果顯示在受到感染后約 3 至 4 小時(shí)出現(xiàn)了連接失效的情況（圖 7B）。

圖7 變形蟲(chóng)感染后在蠕動(dòng)條件下的組織降解

A) 死細(xì)胞占總死細(xì)胞的百分比(N=8)。基于E-鈣粘蛋白連接的組織連接性評(píng)估(N=6)

組織降解的過(guò)程也通過(guò)熒光顯微鏡進(jìn)行了觀察（圖 8）。簡(jiǎn)而言之，在感染過(guò)程中，溶組織內(nèi)阿米巴（紅色）降解了刷狀緣上的肌動(dòng)蛋白（紫色），吞噬了死亡細(xì)胞（黃色），并切斷了 E - 鈣黏蛋白（綠色）連接。本研究闡明，蠕動(dòng)運(yùn)動(dòng)積極地促進(jìn)了這一過(guò)程，突顯了感染機(jī)制與組織力學(xué)之間的緊密聯(lián)系。

圖8 類(lèi)變形蟲(chóng)感染后1小時(shí)和3小時(shí)的組織降解及侵襲過(guò)程。

紅色：變形蟲(chóng)；紫色：肌動(dòng)蛋白；綠色：E-鈣黏蛋白；黃色：死亡細(xì)胞（比例尺為20微米）。

溶組織內(nèi)阿米巴分泌的半胱氨酸蛋白酶對(duì)于高效降解和侵入人體結(jié)腸組織至關(guān)重要。在使用半胱氨酸蛋白酶抑制劑（E64）的芯片實(shí)驗(yàn)條件下，無(wú)論是有蠕動(dòng)（WP）還是無(wú)蠕動(dòng)（WOP）的情況，都未再觀察到組織降解和寄生蟲(chóng)侵入的現(xiàn)象（圖 9）。這凸顯了半胱氨酸蛋白酶活性在有效分解和侵入組織過(guò)程中的關(guān)鍵作用，同時(shí)也驗(yàn)證了芯片上器官（OoC）是研究阿米巴病初始階段的一個(gè)準(zhǔn)確模型。

圖9 變形蟲(chóng)感染7小時(shí)后的共聚焦z軸層疊圖像。

左側(cè)為未使用半胱氨酸蛋白酶抑制劑的情況，右側(cè)為使用了半胱氨酸蛋白酶抑制劑（E64）的情況，

上方為存在蠕動(dòng)運(yùn)動(dòng)的情況，下方為不存在蠕動(dòng)運(yùn)動(dòng)的情況。

4.3.2 局部機(jī)械應(yīng)力增強(qiáng)類(lèi)變形蟲(chóng)的入侵能力

最終研究確定，與沒(méi)有蠕動(dòng)的情況相比，蠕動(dòng)會(huì)減少變形蟲(chóng)在上皮組織上的遷移，從而有助于其侵入組織。通過(guò)使用與分析局部應(yīng)力相同的關(guān)聯(lián)方法，將單個(gè)變形蟲(chóng)的侵入速度與局部應(yīng)力水平進(jìn)行比較后發(fā)現(xiàn)，從統(tǒng)計(jì)學(xué)角度來(lái)看，在由蠕動(dòng)運(yùn)動(dòng)引發(fā)的較高應(yīng)力區(qū)域，寄生蟲(chóng)侵入成功的概率更高。

5 結(jié)論

蠕動(dòng)在腸道組織更新過(guò)程中發(fā)揮著作用，它能促使上皮細(xì)胞和微生物群脫落。抑制胃腸蠕動(dòng)通常會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌過(guò)度生長(zhǎng)，這表明蠕動(dòng)運(yùn)動(dòng)對(duì)于降低感染風(fēng)險(xiǎn)從根本上來(lái)說(shuō)至關(guān)重要。然而，研究結(jié)果表明，盡管福氏志賀菌和溶組織內(nèi)阿米巴在大小、生命周期和感染機(jī)制上存在顯著差異，但蠕動(dòng)運(yùn)動(dòng)卻是這兩種病原體侵入的決定性因素。這些病原體已經(jīng)進(jìn)化到能夠利用結(jié)腸環(huán)境信號(hào)，這意味著我們需要重新審視在靶器官生態(tài)位中研究宿主與病原體相互作用的方式。蠕動(dòng)運(yùn)動(dòng)和局部機(jī)械應(yīng)力對(duì)這兩種病原體感染的影響概述如圖 10 所示。

圖10 蠕動(dòng)運(yùn)動(dòng)和局部機(jī)械應(yīng)力對(duì)福氏志賀菌和溶組織內(nèi)阿米巴侵襲策略的影響。

使用Biorender軟件繪制。

引用
[1] A. Boquet-Pujadas et al., “4D live imaging and computational modeling of a functional gut-on-a-chip evaluate how peristalsis facilitates enteric pathogen invasion," 2022. [Online]. 

[2] A. Grassart et al., “Bioengineered Human Organ-on-Chip Reveals Intestinal Microenvironment and Mechanical Forces Impacting Shigella Infection," Cell Host Microbe, vol. 26, no. 3, pp. 435-444.e4, Sep. 2019, doi: 10.1016/j.chom.2019.08.007.